Callum Lynch (Michael Fassbender) wartet im Todestrakt auf seine Hinrichtung. Der Wissenschaftler Joseph (Brendan Gleeson) bietet ihm jedoch die Möglichkeit, Teil eines außergewöhnlichen Experiments zu sein: Callum wird Proband für eine Maschine namens Animus, die es seinen Nutzern ermöglicht, die Erinnerungen ihrer Vorfahren zu durchleben. Zur Zeit der spanischen Inquisition verkörpert Callum so den Assassinen Aguilar de Agarorobo, Mitglied eines im Schatten operierenden Geheimordens und Sohn eines ihrer größten Anführer. Im Zentrum seiner gelebten Erinnerung steht der Jahrhunderte alte Konflikt zwischen den Assassinen und den machthungrigen Templern. In der realen Welt bekommt Callum Unterstützung durch die Assassinin Lara (Octavia Selena Alexandru), sein Gegenspieler in der Gegenwart ist Alan Rikkin (Jeremy Irons), CEO und Anführer der modernen Templer. Und auch Rikkin hat ein Gegenstück im Spanien des 15. Jahrhunderts: Tomas de Torquemada, die ehemalige rechte Hand des korrupten Rodrigo Borgia, der seinerzeit zum Papst aufstieg.
